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药用植物组织培养体系建立的影响因素

?作者: 组培设备 发布时间:2020-03-16 17:02?? 浏览次数:

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  在植物组织培养过程中,虽然是人工控制营养条件和环境条件,可以克服种子繁殖中存在的诸多问题,但在离体培养过程中,外植体自身和培养条件对组织培养体系建立的成功与否仍有着很大的影响。

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  1、外植体

  1.1 外植体选择 外植体的植物基因型、种类、来源、大小、取材季节及外植体的生理状态和发育年龄等因素,在很大程度上决定了组织培养的难易程度,甚至成败。选取旱半夏的叶、叶柄、珠芽3种外植体进行比较,研究不同外植体的愈伤组织诱导效果,结果表明,相比较而言,以叶片作为外植体更利于愈伤组织的诱导,不仅诱导率高,且再生苗生长情况也较好。分别以叶片、叶柄、茎、花瓣和花柄为外植体,探究了不同外植体对黄精叶钩吻愈伤组织诱导的影响,结果表明:在5种外植体中,诱导愈伤组织的最佳外植体为茎段。以茎段为外植体时出愈率高、愈伤量大,且配合诱导愈伤组织最佳的培养基时效果更佳。选取1月刚长出的嫩茎、嫩叶以及黄精根茎为研究材料,探讨了黄精不同外植体对愈伤组织诱导的影响,结果显示,以根茎和嫩茎为外植体时的褐化率较高,无法愈伤成功,相比之下,黄精最佳外植体选择应为黄精嫩叶,其较容易诱导出愈伤组织,且褐化现象较轻,成活率很高。

  1.2 外植体消毒 在植物组织培养过程中,外植体体内自生的微生物如病毒、类病毒、细菌等,会带来内源性污染,一般外在的消毒方式不能将其清除,可采取添加青霉素、链霉素、利福平等抗生素和杀菌剂结合使用,以达到灭菌的效果。筛选出药用植物猴耳环种胚的最佳灭菌方式为:0.1%HgCl2处理12min,污染率16.10%,无菌萌发率78.66%。在半寄生药用植物百蕊草的组织培养研究中指出,愈伤组织诱导培养过程中,以茎为外植体时,诱导效果优于叶,但污染率高于叶,分析原因可能是茎内自身的次生菌所致。在桔梗微体快繁与脱毒技术的研究中指出:分化好的无菌桔梗小苗采用高温与茎尖相结合的办法,有利于去掉桔梗小苗本身所带的病毒,并采用电子显微镜观察法鉴定采用以上方法可除去桔梗的病毒。对南方红豆杉外植体的消毒方式筛选后,提出了诱导时控制染菌率的最适宜消毒方法:75%酒精0.5min+0.1%氯化汞8min,培养基中添加0.35%的丙酸钠杀菌剂。

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  2、培养条件

  2.1 培养基 培养基是植物组织培养中最主要的部分,为植物组织提供所需的无机和有机营养成分,供植物生长发育。Francesca E. 通过添加不同浓度的细胞生长素和细胞分裂素的MS培养基,研究其对诱导丝叶苍角殿(Schizobasis intricata)外植体球茎形成的影响,结果表明,培养基中添加2mg/L苄基腺嘌呤和2mg/L萘乙酸的激素组合诱导的茎尖反应最好,平均每个外植体产生14.1个芽。此外,还发育出愈伤组织。通过反复在同一培养基上进行继代培养的方法,使鳞茎的形成不再需要一段暗培养的时期。在鳞茎直径大于3mm时,进行了生根试验,最佳培养方案为培养基1/2MS+NAA1mg/L,平均每个鳞茎在35d内生根8根,且根部的硬化是非常成功的。选用固体培养法培养,通过MS、B5、N6这3种不同基本培养基以及KT、2,4-D、6-BA3种外源生长调节物质的对比试验,筛选出虎杖愈伤组织的适宜培养基为基本培养基MS,激素种类为适当浓度的NAA或KT,且发现添加KT的培养基上诱导的愈伤组织较紧密,有利于分化。培养基MS+NAA2mg/L+KT 0.1mg/L上诱导愈伤组织较好,根茎芽的诱导率最高达73%。在四川大叶黄精组培快繁技术研究中对比了不同培养基对根茎芽萌发、不定芽分化、生根和不同激素组合对壮苗的影响,结果表明,以大叶黄精的地下根茎芽为外植体时,最适宜的初代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L,萌发率达35%。不定芽分化培养基为MS+6-BA0mg/L+NAA0.2mg/L,平均不定芽诱导个数为4.33个。壮苗培养基为MS+6-BA1.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+GA3 0.5mg/L。生根培养基为1/2MS+NAA 1.0mg/L+IBA0.2mg/L+AC0.2g/L,生根率达89%。其中,细胞分裂素6-BA在大叶黄精生长过程中起着重要作用。通过在培养基中适当使用植物生长调节剂的方法对石斛组织培养模式进行了研究,结果表明,含有1mg/L meta-topolin和0.8mg/L Putrescine的MS培养基,石斛外植体的芽增殖率最高;添加吲哚丁酸2mg/L和0.5mg/L phloroglucinol的半强度MS培养基,生根率较高,最高达10.1根/枝。利用SCoT和IRAP等分子标记对再生植株进行遗传稳定性评价,发现再生植株具有较高的遗传稳定性。并采用DPPH、FRAP和金属螯合试验对母本和微繁植物的抗氧化能力进行了评价,结果显示,微繁殖植株抗氧化活性显著提高,繁殖快,具有更高的遗传稳定性和抗氧化能力。

  2.2 光照条件 光照条件对植物细胞、组织、器官的生长和分化及次生代谢物质积累水平有着不容忽视的影响。光对于植物组织培养的影响主要表现在光质、光照强度以及光照时间等方面。一般来说,黑暗条件对于细胞、愈伤组织的增殖更有利,一定的光照条件对器官的分化更有利。研究表明,在L30光强条件下,从生长角度来说,最适合台湾金线莲的生长发育。对比了不同光照条件下三七愈伤组织的生长和皂苷积累情况,与对照材料比较后发现,愈伤组织在光下培养后发生分化,表面变绿,甚至长出幼芽,光照可以促进愈伤组织的分化,抑制皂苷积累。筛选了人参不定芽诱导的光照条件,结果表明,交替光照条件下不定芽的分化系数高于全黑暗和全光照培养,全光照条件利于不定芽增殖。

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  2.3 其他条件 在药用植物组织培养中,温度、通气、湿度等培养条对药用植物诱导、生长和分化同样具有很大的影响。在牛蒡的组织培养研究中采取培养条件:温度(25±1)℃,光强1000lx,光照时间14h/d诱导无菌苗,待生根,小植株长到5~6cm时,将培养间光照强度改为1500~2000lx,炼苗2d后移栽,保持湿度情况下,移栽成活率达80%。研究表明,pH和培养转速与矮紫杉细胞悬浮培养褐化呈负相关关系,磷源对细胞褐化的影响远大于氮源,一定程度的光照促进了细胞的生长增殖,光照强度过大则会出现褐化现象;因此,2mB5培养基、24h光照、强度1500lx、pH7.0、22℃、90r/min为最优培养条件。筛选出药用植物青天葵悬浮培养的合适pH值为6.0,蔗糖浓度为1%;同时,也发现暗培养条件能加快愈伤组织的生长速度。

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